ここでは遺伝子工学の生化学的な側面についてはあまり述べず、遺伝子工学で使われる工学技術について説明する。
遺伝子はDNA上の塩基配列であり、それを情報として読みとることは遺伝子工学においても重要な技術の一つである。遺伝子配列の決定法には
Dideoxy法（サンガー法）や化学分解法（Maxam
Gilbert法）がある。
Dideoxy
法は、放射性標識した異なる塩基のDideoxy
NTPをそれぞれ４種類用意し、それを含むバッファ中でDNA合成を行う。合成されたDNAはDideoxy
NTPが結合した段階で、それ以上合成が進まなくなり、各塩基に対応した長さで止まる。それらを別々のレーンで電気泳動し、バンドの現れた位置から塩基配列を決定する。一回の電気泳動で数千塩基を読むことができる。
この方法では
１、 放射性物質を用いるので危険
２、 レーンごとの泳動度の違いによる読みとり誤差がある。
等の問題があり、現在は色の違う蛍光標識とレーザースキャンを組み合わせ、１レーンで実時間読みとりが可能な装置が開発され、高速の塩基配列決定が可能になってきた。
キャピラリ電気泳動
また、最近ではキャピラリ電気泳動を用いて微小量サンプルを高速で読みとる方法が開発されている。キャピラリ電気泳動は細いガラス管の中にDNA試料をいれ、両端から電界をかけることでDNAを電気的に泳動させる方法で、DNAの分子サイズによる泳動速度の差から、ゲル電気泳動と同じ分離が可能になる。この方法では試料がマイクロリットル程度で済み、また放熱効率がよいので高電圧を印加して高速の分離が可能になる。ヒトゲノムプロジェクトではこのキャピラリ電気泳動装置が主に利用された。
さらにこのような泳動装置を微細加工技術を用いて一枚の基板上に複数回路製作し、一度に大量のDNAをシークエンスする方法が開発されつつある。
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化学分解法は今ではあまり使われなくなっている。
Polymerase Chain
Reactionは、温度変化を利用して、一つの溶液中でDNAを複製、増幅する方法である。基本的な１サイクル中のステップは以下のようになる。
A,DNAの熱変成による一本鎖化（９５度）
B,アニーリングによるプライマの結合（７０度）
C,ポリメラーゼによる相補的DNAの合成（７２度）
この繰り返しごとにDNA量は倍に増える。原理的には１本のDNAからでも任意の量までDNAを増幅することができる。ここでキイとなる技術は
１，DNA変成温度にも耐えるDNAポリメラーゼ
２，液温を正確に制御する装置
である。
１，のTaqポリメラーゼは温泉に生息する細菌からとられたDNAポリメラーゼで、高温でも失活しない。
２，の温度制御装置はサーマルサイクラーなどと呼ばれ、温度の正確さと温度変化のはやさが必要なため、熱容量、熱抵抗の小さい構造、材料が選ばれる。
現在μマシン技術を用いて反応容器をミリメートル以下まで小さくした、高速PCR装置が開発されていて、試験的には数分で数千倍の増幅が可能になっている。さらにサーマルサイクラーのパッケージ化と蛍光標識による増幅の実時間モニタにより、可搬式の遺伝子増幅装置が開発されている。
DNAの塩基配列は、高い精度で相補的配列を認識し、ハイブリダイズする。この性質を利用すれば特定の配列に対して高い特異性を持ったセンサが実現できる。そのような試みがDNAチップである。DNAチップは、基本的には基板上の小さなスポットに特定の配列を持つDNAを特異的に固定化し、そこに結合するDNAを認識することで容易に塩基配列や遺伝子を検出しようというものである。特定のスポットにはどのようなDNA配列があるか分かっているので、DNAがハイブリダイズしてスポットの並びから、DNAの塩基配列が分かる。
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このような技術のひとつにアフィメトリックス社のジーンチップがある。ジーンチップは光リソグラフィ技術を利用してグリッド上にDNAを任意配列のDNAを合成するものである。 |
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最近多く使われているのは、単に細い棒の先にDNA溶液をつけ、一点ずつ自動的にスポットしていく技術である。（オムニグリッド装置） |
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FISH、共焦点レーザー、１分子観察
かって光学顕微鏡観察は回折限界のためあまりこれ以上の進展は期待できないかと思われたが、蛍光観察は光学顕微鏡による１分子の観察を可能にした。屈折や散乱をみる限りは、光の波長以下の大きさの物体を観察することは原理的に不可能である。しかし、物体自体が光を発している場合は、その大きさに関わらず観察が可能で、その限界は検出器（目も含める）の感度で決まる。
分子に蛍光性分子でラベルを行うことで、一分子を光学的に見ることができるようになった。
これを応用して、RNAポリメラーゼのDNAへの結合様式を調べた例がある。
RNA Polymeraseは遺伝子の発現を決定する重要な酵素で、遺伝子上流のTATAボックスを認識して遺伝子のmRNA合成を開始する。しかし、長いDNAの配列上からTATAボックスをいかに見つけるのかは謎であった。実際、熱運動によって偶然にTATAボックスに結合する確率は非常に低いと考えられるので、とりあえずDNAに結合し、その上を滑っていくうちにTATAボックスに出会うとRNA合成が始まるのではないか（滑り説）と言われていたが、その証拠はなかった。そこで、DNAをのばした状態で固定し、そこに蛍光ラベルしたRNA Polymeraseを結合させることで、一分子の動きを観察した。結果として、RAN PolymeraseがDNA上を滑って運動する様子が観察され、滑り説が証明された。
その他
さらに最近走査型トンネル顕微鏡を用いてDNAの観察が可能になった。DNAは螺旋のようには見えるが、分子モデルとは違った描像が得られる。これはトンネル顕微鏡が分子自身を見るのではなく、フェルミ準位付近の電子軌道を見るため、電子軌道の広がったπ電子系などが強調されるためのである。このような高解像度のDNA画像は電子顕微鏡、原子間力顕微鏡などでも得られる可能性はある。そのような観察手段を用いることでDNAの直接観察、直接シークエンスの可能性もある。
ゲノムDNAのシークエンシングは通常行われる遺伝子のシークエンシングとは本質的に違う部分がある。それはここのDNAの長さである。通常の遺伝子はタンパク分子をコーディングしているため、アミノ酸配列にしておおよそ100〜1000アミノ酸残基ぐらい。塩基配列にすれば数千塩基対ぐらいになる。塩基の配列決定は、どの手法でも１サンプルにつき、おおよそ5000塩基ぐらいが限度となる。また、YACベクターやコスミド・ベクターが開発されるまで、DNAライブラリを保持するためのベクターも数千塩基を入れるのが精一杯だった。それでも、cDNAのようなひとつの遺伝子についてなら、大きなものでも数個の断片にわけ、何回か重複させて配列決定して断片をつなげれば十分である。
しかし、ゲノム解析の場合は全体の配列が109個のオーダーになり、それを切り出した断片でも、106塩基対程度のものになってしまう。幸い、YACベクターの開発でDNA自体の操作は可能になったものの、配列決定はさらに細かい断片化とその再構成が必要である。
ゲノムDNAの配列決定には、まずすでに染色体上の配置が分かっている遺伝子をマーカーとして、コンティグマップを作る。これは数Ｍbpの断片同士の相対位置を決定するものである。コンティグマップが決定されたら各断片を制限酵素で分解してさらに細かくわけ、それぞれの配列を決定する。このとき、隣り合う配列が分からなくならないように、複数種類の制限酵素断片を用意し、重なり合いを作りながら断片同士を継ぎ合わせて、最終的に全配列を決定する。このように遺伝子を一歩一歩継ぎ合わせていく方法をジーンウォーキングと呼ぶ。
ウォーキングは確実な方法ではあるが、同じ遺伝子配列を何度も重複して読み返すので手間がかかる。それに対してセレラ社では、ランダムに読んだシークエンスをコンピュータ上で組み合わせ、配列を推定する方法がとられた。この方法をショットガンシークエンスと呼んでいる。やはり数種類の制限酵素で切断した断片の両端600塩基対だけを読み（図の黄色）それらをコンピュータ上のデータベースに読み込んで重なり合う可能性のある部分をつなぎ合わせている。この方法により、ヒトゲノムプロジェクトは予想より２年近く早く終了した。しかしながら、この方法が成功した理由は、すでにウォーキングにより解読が進んでいた部分を使って修正を行ったからである。事実、ショットガンを使って配列決定されたショウジョウバエでは致命的な読みとりミスがあったことを、セレラ社も認めている。
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一方で、ナノジェン社のDNAチップは電気的な反発を利用して任意のスポットにDNAを固定化する技術である。これにより、ハイブリダイゼーションの効率も制御できる。
