BME 3 Nucleic acid

３、核酸

核酸とは、眞核生物の核から大量に抽出された酸性物質のことで、いわゆるDNAとＲＮＡのことを指す。

１，核酸の構造

　

リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチド

　ＲＮＡはリボムクレオチドの直鎖状のポリマーのことを指す。ＤＮＡはリボヌクレオチドのリボースから酸素原子一つがかけたデオキシリボヌクレオチドのポリマーである。

　（デオキシ）リボヌクレオチドは五炭糖のリボース、窒素を含んだ環状化合物である塩基、そしてリン酸からできている。リン酸がリボースの３番と５番の炭素をエステル結合で結んで、長い直鎖状の分子ができる。

　（デオキシ）リボヌクレオチドの鎖からは側鎖として塩基が生えていて、それらが互いに弱い結合で結びつくことで逆向きの２本の鎖が安定な構造をとる。

　

DNAの構造

ＤＮＡの塩基にはＡＴＧＣの４種類がある。

各塩基分子には窒素原子が含まれており、アルカリ性（塩基性）を示す。この窒素と酸素および水素に局在する電子が水素結合を形成する。

　

RNAの構造

　RNAはDNAとともに核酸と呼ばれ、構造上はDNAの糖（リボース）の２位の水素が水酸基OHに置き換えられた構造をしている。また、塩基としてはチミンの代わりにウラシルが用いられるが、これも構造上の違いはわずかである。しかし、このわずかな化学構造上の違いによって、その機能は大きく異なっている。

リボースの構造

　

　→　

　

ＤＮＡの２重螺旋構造

　ＤＮＡは２種類のプリン塩基Ａ，Ｇとピリミジン塩基Ｔ，Ｃがついたデオキシリボヌクレオチドが直鎖上につながったものが、２本、相補的配列で逆向きに対合したもの。塩基間には水素結合がつくられ、ＡＴ、ＣＧのペアで対合する。組み合わせの間違いも時に発生して遺伝子の変異の原因となるが、多くの場合すぐに酵素によって修正されてしまう。

　ヌクレオチド同士はリン酸のエステル結合で結びつけられる。このとき、リボースの炭素の番号を取って一方を３'末端、もう一方を５'末端と呼ぶ。ＤＮＡは5'から3'末端へ向けてしか合成されない。（遊離3'ＯＨにＸＴＰが結合する）

　

２，DNAの働き

○もともと正体不明であった核酸が遺伝子を担っていることが分かったのは以下のような経緯によるものである。

1928 Griffithの実験

肺炎双球菌Streptococcus Pneumoniae(ＳＰ）

きょう膜を持たないもの（非毒性）＋毒性ＳＰの細胞抽出液ー＞病原性ＳＰ

何かが遺伝情報を伝えたらしい。

　

1943 Averyらの実験

きょう膜を持たないもの（非毒性）＋毒性ＳＰのＤＮＡー＞病原性ＳＰ

　ＤＮＡが遺伝情報を伝えたらしい。しかし一緒に入り込んだタンパクなどの成分が情報を伝えたのかもしれない。このころはＤＮＡはＡＴＧＣからなるテトラヌクレオチドと信じられていた。このためこのaveryらの結果は信用されなかった。

1952 Harshey,Chaseの実験

放射性ラベルした、ＤＮＡ32Pとタンパク質35Sを食べさせたファージを大腸菌に感染させたときになにが入り込み、娘ファージに伝えられるか。

培養して得られた娘ファージにはＰしか入らなかったことから、ＤＮＡが遺伝情報を伝えることが確実になった。

1953 Watson-Crickの２重螺旋モデル。

結晶化DNAのＸ線回折からＤＮＡの２重螺旋モデルを提案。螺旋構造をした２本のＤＮＡ差の塩基の配列が遺伝情報を載せている。

　

遺伝子

　遺伝子とは、ＤＮＡそのものを指すのではなく、生物に発現する一塊の形質を伝える遺伝情報のことを指す遺伝学上の言葉。これがＤＮＡの塩基の配列によって実現されている。一つの遺伝子はおおよそ一つのタンパク質に対応すると考えられる。

ＤＮＡの情報量は2.9kbp/um

ヒト 6x109bp ,1.5GByte 長さ 2m 30,000遺伝子

大腸菌 3x106bp 0.8MByte 1mm 5000遺伝子

実際に働いているのはDNAの数％だけで、後のDNAがなにをしているのかは不明。

　

　

３，セントラルドグマ

転写：ＤＮＡー＞ＲＮＡ

ＲＮＡポリメレース

　転写は核（正確には核であったところ）で行われる。ＤＮＡは染色体のように密な状態ではないが、２重螺旋構造では転写することはできない。２重螺旋構造を分離させ、絡まったねじれを戻す必要がある。このためにも酵素が働いている。（toptisomerase I,II(Gyrase),Helicase）
　ＤＮＡ上の遺伝子はオープンリーディングフレーム間をイントロンがつないでいる。転写前、および転写段階でイントロンはデリーションを受ける。最終的に合成されたＲＮＡは核からタンパク合成信号をリボソームの伝えるので、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼ばれる。ｍＲＮＡがタンパク合成のテンプレートになる。ｍＲＮＡは5'から3'に向かって合成される。

翻訳：ＲＮＡ−＞ポリペプチド

翻訳は細胞質中のＥＲ上または単独のリボソームにおいて行われる。

リボソームはリボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）とタンパクの複合体。直径20nm。

眞核生物では６０Ｓと４０Ｓ（計８０Ｓ）のユニット、原核生物では５０Ｓと３０Ｓ（計７０Ｓ）のユニットからなる。Ｓ：沈降係数（Svedberg）

リボソームは触媒の働きをし、ｍＲＮＡの配列にあわせて相補的な配列を持つｔＲＮＡを対合させて、それに対応したアミノ酸をつなげる。配列にしたがって次々にアミノ酸が結合され、ポリペプチドが合成される。

ｔＲＮＡは ７６bのＲＮＡで、末端にアミノ基を結合している。一方一部にアミノ酸に対応する配列の３塩基が存在し、その配列がコドンに対合する。この配列をアンチコドンと呼ぶ。

コドン表

1＼2

U

C

A

G

UUU

Phe

UCU

Ser

UAU

Tyr

UGU

Cys

UUC

Phe

UCC

Ser

UAC

Tyr

UGC

Cys

U

UUA

Leu

UCA

Ser

UAA

term

UGA

term

UUG

Leu

UCG

Ser

UAG

term

UGG

Trp

CUU

Leu

CCU

Pro

CAU

His

CGU

Arg

CUC

Leu

CCC

Pro

CAC

His

CGC

Arg

C

CUA

Leu

CCA

Pro

CAA

Gln

CGA

Arg

CUG

Leu

CCG

Pro

CAG

Gln

CGG

Arg

AUU

Ile

ACU

Thr

AAU

Asn

AGU

Ser

AUC

Ile

ACC

Thr

AAC

Asn

AGC

Ser

A

AUA

Ile

ACA

Thr

AAA

Lys

AGA

Arg

AUG

Met(ini)

ACG

Thr

AAG

Lys

AGG

Arg

GUU

Val

GCU

Ala

GAU

Asp

GGU

Gly

GUC

Val

GCC

Ala

GAC

Asp

GGC

Gly

G

GUA

Val

GCA

Ala

GAA

Glu

GGA

Gly

GUG

Val(ini)

GCG

Ala

GAG

Glu

GGG

Gly

翻訳によってタンパク分子のアミノ酸配列が作られるが、それだけで正常なタンパク分子として働くことは希である。実際のタンパク分子は膜や細胞内器官（ゴルジ、ＥＲ）において、切断や補欠分子の結合などのプロセッシングを受けてはじめて機能的なタンパク分子となる。

　

プロセッシング

pretranslational processing

　 DNAまたはmRNAの状態で受けるプロセッシング。イントロンなどの不要な配列を切り放し、いわゆる遺伝子の配列を作る。

posttranslational processing

　合成されたペプチドに対するプロセッシング。細胞な局在を促すシグナル配列の処理や糖、ヘム、その他の補欠分子の結合、不要な部分の切断などの処理を受けながら、最終的な細胞内の機能部分に輸送される。

このような手順を踏んでタンパク分子が作られる。

逆転写酵素リバーストランスクリプテース

レトロウィルス（ＲＮＡウィルス）

リバーストランスレースはあるのか？

つまり、タンパク分子が遺伝情報を書き換えることがあるのか。

今の所見つかっていない、が環境によって遺伝子が変わるという報告がある。（真偽不明）

　

遺伝子の発現制御

ラクトースオペロン

｜ｉ｜ｐ｜ｏ｜　z　｜　y　｜　a　｜

　オペロン　｜　遺伝子

ｉ：リプレッサー遺伝子：トランス因子（可溶性因子）リプレッサーを産生。リプレッサーはオペレータに結合して、ｍＲＮＡの合成を阻害する。しかしインデューサが結合すると、ｏに結合できなくなる。

ｐ：プロモータ：とにかくｍＲＮＡの合成を開始させる。

ｏ：オペレータ：ｐの下流でｍＲＮＡ合成を制御するポイント。シス（自分の側）にしか効かないので、立体構造自体が認識を受ける。

ｚ：βーガラクトシダーゼ ラクトース分解酵素。グルコースとガラクトースに分解。

ｙ：ラクトーストランスフェレース ラクトースの細胞内への輸送

ａ：トランスアセチレース

ｃＡＭＰ＋ＣＡＰ（Catabolite Activator Protein）

　

gene

pruduct

function

lacI

repressor

RNA polymerase inhibition

p

null

promotor: RNA polymerase binding site

o

null

operator: repressor binding site

lacZ

β-galactosidase

lactose digestion to glucose

lacY

lactose permiase

lactose transpermiation into the cell

lacA

thiogalactoside acetiltransferase

acetilation of lactose

ラクトース

Ｄグルコース４−１Ｄガラクトース

　

４，DNAの複製、修復

ＤＮＡ−＞ＤＮＡの複製

細胞分裂

　細胞が分裂するときには全く同じＤＮＡの組（ゲノム）が二つ存在しなければならない。ＤＮＡはＳ期と呼ばれる時期に細胞内で複製される。このときは染色体構造は取っていない。

　

巻き戻し

　分裂が近づくとＤＮＡは二組が対になり、染色体構造になる（Ｍ期）。染色体はＤＮＡがヒストンなどのタンパクを骨格として密に巻き込まれたもの。非常に長いＤＮＡが巻き込まれているので、ＤＮＡのねじれをほどくtopoisomelaseの存在が不可欠。

Topoisomerase I：２本鎖のうち一本を切断して、もう一本をくぐらせるてから再度結合することができる。ねじれた２本鎖DNAをほどくことができる。

Gylase：２本鎖DNAを切断し、他の部分をくぐらせてから再度結合する。絡み合った２本鎖DNAをほどくことができる。

　

ＤＮＡポリメラーゼ

　ＤＮＡポリメラーゼには複数種があるが、いずれも5'-3'の合成をおこなう。ＤＮＡポリメラーゼがDNAを合成する際には、はじめに数塩基対のプライマーが必要になる。プライマーはＲＮＡで、DNAの特定の配列に対して、primaseが結合して３ー５塩基のプライマーを作る。プライマーは最終的にPolyIによって除去される。DNAPolymeraseＩは同時に5'-3'のエキソヌクレアーゼ活性を持つ。合成されたＤＮＡを分解しては合成するので、これにより複製の間違いが修正される。直線状の２本鎖DNA上のニック（一方の鎖の切れ目）や一本鎖領域の修復をおこなう。例えばPolymeraseIIIによるDNA合成の際に発生する、岡崎フラグメントの間をつなぐ役割がある。ただし、最終的にニックを結合させるのはLigaseの働き。

　 DNAPolymelaseIIIはＤＮＡがＹ字に分かれた分岐点の一本鎖領域に結合し、ＤＮＡ合成を行う。一本鎖領域はHelicaseが二重螺旋をほどくことで作られる。このときleading鎖では5'-3'の普通の合成が起きるが、3'-5'の側rugging鎖では進行方向にDNA合成が行えない。そこで小さなフラグメントごとに合成が起きる。これを岡崎フラグメントと呼ぶ。Ｙ字型の分岐点はHelicaseによって広げられる。

Helicase：DNAの一本鎖部分に結合し、ATPのエネルギーを利用して２本鎖部分を１本鎖化する。

　

5,遺伝子の変異

組み替えreconbination

　相同なＤＮＡが２本ある時、同じ配列どうした組変わって遺伝子を入れ替えることがある。これを組み替えと呼ぶ。組み替えは一部一本鎖化したＤＮＡにRecAタンパクが結合して起きる。このとき欠損があるＤＮＡはＤＮＡｐｏｌｙｍｅｌａｓｅＩにより修復される。

　

点突然変異

　DNA合成の途中で間違いが起きることがある。複製一回あたり10-4。多くはＤＮＡpolyIにより修復されるが、10-9程度の間違いが発生する。細胞によっては更に修復機構が働くので、本当の変異確率はもっと少ない。また結果変異が起きたとしても

  1. 全く関係ない配列で、影響はない。 ９８％のＤＮＡ部分
  2. 致死的な変異で細胞は死ぬ。 残りのほとんど。特にインサーション、デリーションではフレームシフトにより全く意味のない配列ができる。
  3. 偶然致死的でない生殖細胞の変異で、細胞は正常な生殖細胞として生き残る。 進化。
  4. 偶然致死的でない体細胞の変異で、細胞は勝手に振る舞い出す。 癌。

ただし、癌化には数カ所の変異が必要。特に生殖細胞は分裂回数が少ないので、変異の確率は割と少ないが、それでも進化は起きている。体細胞では細胞数が多いので変異は確実に起きているが、いずれ死滅すべき細胞群であるのであまり問題ではない（本人にとってはときに大きな問題だが。）

　

プラスミド

　細菌では通常のＤＮＡの他にプラスミドと呼ばれる独立した微小なＤＮＡがある。ウィルスの前身かまたはなれの果てかもしれない。実際にこれが表現型を持っている（薬剤耐性など）。このプラスミドに必要な遺伝子を組み込んでを菌に導入すれば、簡単に遺伝子を発現させることができる。このための半人工的プラスミドをベクターと呼ぶ。大きさ数千から十万bp

　

トランスポゾン

　多細胞生物でもゲノム内に簡単に移り変われるＤＮＡを持っている。そのような遺伝子をトランスポゾン（transiposon）と呼ぶ。トランスポゾンは2kbp以上の長さで、両端の反復配列と間に挿入されたトランスポセース（transposase）遺伝子、その他の遺伝子からなっている。トランスポゾンはトランスポゼースの働きにより、もともとの位置から切り出されて、染色体の別の位置に挿入される。挿入位置が何らかの遺伝子上であれば、その遺伝子は正常に機能しなくなり、欠損したのと同じ事になる。同じ個体内でも細胞ごとにトランスポゾンの位置が変わり得るので、部位によって異なった形質を持つことがある。たとえばアサガオの花の色や、トウモロコシの種の色など。

　

　

６，RNAの機能

　ＲＮＡはＤＮＡに比べて細胞内での分解速度が遙かにはやい。これはＲＮＡがタンパク合成のテンプレートであり、その量で合成速度を制御しているためと考えられる。蛋白を合成する必要がなくなれば、すぐにRNAを分解してタンパク合成を止める。　　

DNA

RNA

糖構造

デオキシリボース

リボース

塩基

ＡＴＧＣ

ＡＵＧＣ

機能

遺伝情報の保持、複製

タンパク合成、遺伝子制御、RNA制御

分解

細胞内、自然界で極めて安定

細胞内で短命、容易に分解される

　mRNAのようにタンパク合成の際にDNAの情報を転写して核外に運ぶ役割を果たすが、それ以外にも２種類のRNAがタンパク合成に関わっている。

tRNA：コドンに対応する塩基配列とアミノ酸を持ち、実質的に翻訳を行う。

rRNA：タンパク合成装置であるリボソームに含まれている。

　

　

　かって酵素機能はタンパクだけに特有と考えられていたが、現在では単独で酵素機能を持つRNAも発見されている。また、RNAを含んだ酵素RNPもいくつか発見されているが、それらはタンパク合成、RNA合成、RNAプロセシング、RNA輸送、細胞寿命決定など、細胞の機能上非常に重要な役割を果たすものが多い。

　RNA単独で酵素機能を持つものをリボザイム、またRNAを含む酵素をRNPリボ核酸タンパクと呼ぶ。

リボザイム

　

テロメラーゼ

　細胞の老化を制御する、染色の末端部分にある繰り返し配列をテロメアと呼ぶ。このテロメアは、通常細胞分裂のたびに削られて、最後になくなってしまうとそれ以上分裂が起きなくなる。しかし、テロメアを再生する酵素がある。これをテロメラーゼと呼ぶが、テロメラーゼはＲＮＡを含んだRNPリボ核酸タンパクの１つである。

　タンパク合成において、RNAは設計図であり、合成装置であり、翻訳装置でもある。このように、細胞の機能を実現するのに必須であるタンパク質の合成においてRNAが非常に重要な役割を果たしている。また、細胞の老化をさえもRNAのよって制御されている。このようにRNAが生物の生命維持において極めて重要な役割を果たしていることを進化論的に考察すれば、生物はRNAが機能する状態から進化してタンパクが機能するようになったと考えるのが自然である。なぜなら、生命の維持に関わる機能は進化の最も初期から存在したと考えるのが自然だからである。特にRNAがない状態ではタンパク自身が存在し得ないからである。このような理由から、地球には過去、RNA生物だけが存在した時期、RNAワールドがあったのではないかという仮説が提案されている。

　

７．遺伝子工学の技術


シークエンシング（配列決定）
マクサム・ギルバート法

DNA末端を放射性のリン（32P)でラベルし、一つ分解しては放射性のあるヌクレオチドの塩基を調べていく方法。


サンガー法

蛍光色素で塩基特異的にラベルしたダイデオキシヌクレトチドを混ぜてDNA合成を行う。途中で止まった末端には塩基に対応した色の蛍光色素が付くので、電気泳動で長さを分けると、塩基配列の順番で色素が並ぶ。 ゲルの例。実際のDNAでは遙かに細かい筋が並ぶ。


遺伝子決定
ノーザンブロット

DNAにRNAを


サザンブロット


ウェスタンブロット
フィンガープリント
フットプリント
c-DNAライブラリ


遺伝子同定
RFLP
DNAチップ


遺伝子導入
プラスミドベクター
Yacベクター
コスミドベクター
ウィルスベクター
エレクトロポレーション
パーティクルガン
ウィルス


遺伝子増幅
ファージ
PCR

　

INDEX　　　前のページ　　　次のページ